کار کردن با کوچکترین موجودات یکی از جالب ترین نکات کار ما است . دنیایی فعال و پویا که در زیر میکروسکوپ دیده می شود بسی بسیار ارزشمند از سایر کار ها در سایر رشته ها است .
باکتری یکی از این موجودات ریز است که در علوم آزمایشگاهی جایگاه خاصی دارد و شناسایی انها راه حل تشخیصی بسیار از ناهنجاری های انسان و حیوان است . از انجا که تشخیص این میکروارگانیسم ها نیازمند راه های پیچیده و بیوشیمی و ... است در یکسری مقاله سریالی بیشتر روش های رایج تشخیصی که در آزمایشگاه های کشور انجام می شود را بیان میکنم تا نکته مثبتی در راهنمایی خودم و سایر دوستاران در شناسایی هر چه بهتر این میکروارگانیسم ها باشد . امیدوارم که مفید واقع شوند . منتظر نظرات شما همکاران و دوستان هستیم .
فهرست مطالب زنجیره ای (به روز می شود)
مقدمه روشهاي رايج و سريع ميكروبشناسي جهت شناسائي باكتريها و قارچها
كشت و شناسائي پاتوژنهاي اختصاصي از نمونههاي جمع آوري شده از بيماران مشكوك به عفونت هنوز هم از مطمئن ترين روشهاي تشخيصي است، حتي اگر سريعترين نباشد. در برخي از موارد (مانند گونههاي ريكتزيا) بازيافت ارگانيسمهاي عفوني مشكل يا غير ممكن است ، در اين موارد بايستي به روشهاي سرولوژيك و يا ساير روشها اعتماد كرد. اما تا زمانيكه تكنيكهاي بيولوژي به نقطه اي از پيشرفت برسند كه به راحتي بتوان توسط شاخصهاي ژنتيكي عوامل عفوني را شناسائي نمود، تشخيص قطعي عوامل عفوني بر اساس جداسازي آنها استوار خواهد بود. در اين بخش كليدهاي تشخيص مورفولوژيك، آنزيماتيك و آزمايشات بيوشيميائي كه جهت شناسائي برخي از عوامل عفوني مورد استفاده قرار ميگيرد شرح داده خواهد شد. برخي از آزمايشات بيوشيميايي مورد استفاده جهت شناسائي باكتريها را ميتوان براي شناسائي قارچها نيز استفاده نمود.
ويروسها را اصولاً توسط آزمايشات بيوشيميايي و آنزيماتيك نميتوان شناسائي نمود. شناسائي ويروسها بيشتر بستگي به مشاهده تخريب اختصاصي بر روي سلولهاي بافت بوسيله تهاجم و تكثير ويروسها دارد (من خودم گاهی ویروس را با آنزیم مقایسه میکنم از نظر اینکه شناسایی ویروس سخته و از طرف دیگر اندازه گیری و شناسایی مقدار آنزیم - که به همین دلیل مقدار تولید آن اندازه گیری می شود- ). از آزمونهاي ايمونولوژيك ميتوان جهت شناسائي آنتي ژنهاي ويروسي در بافت يا كشت بافتي استفاده نمود. قارچها و انگلهاي يوكاريوتيك اساساً توسط مشاهده خصوصيات مورفولوژيك ارگانيسم شناسائي ميشوند.
اهداف پايه در شناسائي پاتوژنها
الف- شناسائي مقدماتي كلني هائي كه بر روي محيط جامد رشد كردهاند
از آنجائيكه بيشتر نمونههاي باليني بر روي يا در داخل چندين محيط مانند آگارهاي انتخابي يا افتراقي تلقيح ميشوند، اولين كليد در شناسائي يك كلني ايزوله شده، طبيعت محيطي است كه كلني باكتري بر روي آن رشد نموده است. مثلاً با استثناعات نادر مانند انتروكوك، فقط باكتريهاي گرم – منفي به خوبي ميتوانند بر روي محيط مك كانكي آگار رشد نمايند و ساير محيطهائي كه داراي مواد مهار كننده رشد باكتريهاي گرم – منفي هستند، مانند كلمبيا آگار كه داراي كوليستين و ناليديكسيك اسيد ميباشد، باعث رشد باكتريهاي گرم – مثبت ميشوند. اغلب باكتريها و قارچها بر روي محيطهائي غذائي يا داراي مكمل مانند آگار خوندار با 5% خون گوسفند و BHI آگار به خوبي رشد مينمايند.
قارچهاي كپكي (Mold like) به علت داشتن ميسيليومهاي هوائي داراي رشد كركي يا پرزدار ميباشند، اگر يك كلني كركي روي پليت محتوي آگار مورد توجه قرار گيرد، قبل از باز شدن يا انجام كارهاي تشخيصي بر روي آن بايد در زير يك هود بيولوژيك قرار گيرد. تمام كلنيهاي باكتريائي بايد بر روي محيط ديگر كشت مجدد داده شوند. قبل از اينكه پليتهاي قارچي را از كابينت خارج نمائيم بايد محيط آن را با نوار چسب گرفته تا از انتشار اسپورها به محيط خارج جلوگيري نمائيم. چنين كاري شانس ابتلا به قارچهاي سيستميك را كاهش داده و از آلودگي ساير محيطها در طي كار بر روي پليتهاي بعدي يا انكوباسيون آنها جلوگيري به عمل ميآورد.
-
عاقلانه نيست كه تمام تلاش خود را بر روي شناسائي مورفولوژي كلني جهت شناسائي باكتري ايزوله شده معطوف نمائيم. چون ممكن است كلني يك ميكروارگانيسم از يك گونه شبيه گونه ديگري باشد.
مثلاً كلنيهاي قارچهاي مخمري اغلب شبيه كلني استافيلوكوك ميباشند. عليرغم متمايز بودن مورفولوژي كلني (مانند كلنيهاي مشخص سودوموناس آئروجينوزا)، يا نماي رشد بر روي محيطهاي انتخابي، بايد مورفولوژي سلولي ميكروارگانيسم مشخص شود. كلني هائي كه بر روي محيطهاي انتخابي رشد ميكنند نيز به رسيدگي بيشتري احتياج دارند (مثلاً برخي از كلنيهاي اشريشيا كلي بر روي محيط هكتون اينتريك قابل تمايز از شيگلا نيستند) آزمايش آماده سازي مستقيم و مرطوب كلنيهاي باكتري در زير بزرگنمائي روغن ايمرسيون ميكروسكوپ (1000×)، با يا بدون ميكروسكوپ فاز كنتراست، ميتواند در تشخيص احتمالي ميكروارگانيسم ما را راهنمائي نمايد، مثلاً تهيه يك گسترش مرطوب از يك كلني آلفاهموليتيك شفاف بر روي آگار خوندار كه در آن كوكسيها به صورت زنجيره اي قرار گرفته اند، با احتمال زياد ميتواند استرپتوكوك باشد، يا باسيلهاي طويل، نازك و متحدالشكل به لاكتوباسيل مشكوك هستند (charming rods). اغلب ميتوان تحرك را بوسيله اين آزمايش اوليه مشخص نموده و وجود سلولهاي مخمري كه كلني آنها شبيه باكتريها ميباشد را كشف نمود.
ب- مرفولوژي باكتريها در رنگ آميزي جهت شناسائي آنها
جهت بدست آوردن اطلاعات مرفولوژيك با ارزش، ميكروبشناس بايد از مواد گرفته شده از كلنيهاي ايزوله رنگ آميزي گرم را انجام دهد. بيشتر باكتريها را ميتوان به چهار گروه مجزا تقسيم بندي نمود، كوكسيهاي گرم - منفي، كوكسيهاي گرم – مثبت، باسيلهاي گرم – منفي و باسيلهاي گرم – مثبت. برخي از گونهها را از نظر مرفولوژي نميتوان از هم متمايز نمود و بوسيلة تركيب عبارات گفته شده توصيف ميشوند مانند: كوكوباسيلهاي گرم – منفي يا باسيلهاي گرم متغير. ساير اشكالي كه با آنها مواجه ميشويم شامل باسيلهاي خميده و اسپيرال هستند. روشهاي شناسائي باكتريها بر اساس مرفولوژي سلولي استوار است. هنگامي كه اين اطلاعات پايه بدرستي مشخص شدند ميتوان به شناسائي قطعي باكتري مبادرت ورزيد. نتايج رنگ آميزي گرم هميشه نشاندهندة ساختمان ديواره سلولي ارگانيسم نيست. مثلاً برخي از باكتريهاي گرم – مثبت (و قارچها) با افزايش سن و تحت شرايط مختلف استحكام ديوارة سلولي آنها از بين ميرود (مثلاً در معرض عوامل ضد ميكروبي قرار گرفتن) و در رنگ آميزي گرم – منفي ديده ميشوند. بسياري از گونههاي باسيلوس و كلوستريديوم (در حد سوش) گرم – منفي ديده ميشوند كه اين خود منجر به انجام آزمايشات تكميلي جهت تشخيص گونه ميگردد.
جهت داشتن يك واكنش رنگ آميزي مناسب از يك ارگانيسم گرم – مثبت مشكوك، رنگ آميزي از ساب كالچر محيط آبگوشتي توصيه ميگردد. حداقل دو سيستم غيررنگ آميزي جهت كمك به تعيين واكنش رنگ آميزي گرم در دسترس ميباشد. معرف اِل-آلانين-4-نيتروآنيليد (LANA) كه بوسيله Carlone و همكاران توصيف شد، جهت تمايز واكنش گرم ارگانيسمهاي هوازي و بيهوازي اختياري مورد استفاده قرار ميگيرد. در اين آزمايش سواب آغشته به معرف با كلني باكتري گرم – منفي تماس داده شده و رنگ زرد ميگيرد. آزمايش هيدروكسيد پتاسيم جهت ارگانيسمهاي مشكوك نيز مورد استفاده قرار ميگيرد. يك لوپ از كني ارگانيسم مورد نظر را در سطح يك اسلايد شيشه اي با KOH 3% به صورت سوسپانسيون در آورده و به مدت 60 ثانيه آنرا دائماً به هم ميزنيم و سريعاً لوپ را از سوسپانسيون خارج ميكنيم، در اثر شكسته شدن ديواره سلولي باكتريهاي گرم – منفي مواد كروموزومي چسبناك آن آزاد شده و سبب ميگردد كه سوسپانسيون غليظ شده و مانند نخ كش مشاهده شود. بسياري از باكتريهاي گرم – مثبت (با چند استثناء مثل برخي از لاكتوباسيل ها) به وانكومايسين (يك آنتي بيوتيك قوي بر ضد ديواره سلولي باكتريهاي گرم – مثبت) حساسند. ممانعت از رشد باكتريها بوسيله وانكومايسين در غلظتهاي پائين در حدود mg/ml3 اغلب در تشخيص احتمالي ارگانيسم گرم – مثبتي كه در رنگ آميزي گرم – منفي ديده شده مفيد خواهد بود. آزمايش غربالگري وانكومايسين را ميتوان با تلقيح كشت سنگين ارگانيسم در قسمتي از سطح آگار خوندار و قرار دادن يك ديسك mg5 بر روي سطح آگار كشت داده شده، انجام داد. بعد از يك شب انكوباسيون هر هاله عدم رشدي معمولاً نشاندهنده يك باكتري گرم – مثبت است. با چند استثناء ارگانيسمهاي گرم – منفي به وانكومايسين مقاوم بوده ولي به كوليستين يا پلي ميكسين در غلظت/ml mg10 حساسند.
ج - آزمايشات بسيار سريع آنزيمي و بيوشيميائي كه ميتوان بر روي كلني رشد نموده بر بروي محيط اوليه انجام داد
تمام آزمايشاتي كه در اين بخش شرح داده ميشوند را ميتوان مستقيماً بر روي يك كلني مجزا شده بر روي محيط اوليه انجام داد. تمام آنها در كمتر از يك ساعت واكنش مثبت ايجاد كرده و كمتر از يك يا دو دقيقه وقتگير هستند، گر چه برخي از آنها احتياج به انكوباسيون تا چهار ساعت ممكن است داشته باشند. چنين آزمايشاتي به تكنولوژيست كمك ميكند كه يك باكتري ايزوله شده با مرفولوژي مشخص را در تقسيم بنديهاي بعدي قرار دهد و آزمايشات اضافي ديگري را كه ممكن است مورد لزوم باشد بر روي آنها انجام و در مورد عفونتهاي خطرناك جهت درمان اوليه يك شناسائي مقدماتي از عامل عفونت را به پزشك گزارش دهد. علاوه بر آزمايشاتي كه در اينجا شرح داده ميشود، آزمايشات ديگري نيز وجود دارند كه در آزمايشگاههاي سراسر دنيا به طور معمول مورد استفاده قرار ميگيرند . با توجه به اهمیت این تستها مانور ما هم بیشتر بر روی این قسمت ها است .
-
امیوارم که با این مقدمه بلند تست های روتین را در ادامه قرار بدهم . تمام تست ها هم به صورت لینک در پست "روشهاي رايج و سريع ميكروبشناسي جهت شناسائي باكتريها و قارچها 1 (مقدمه)" قرار خواهند گرفت .
