|الایزا به علت حساسیت زیادی که به محیط و هم چنین خطاهای کاربری دارد تستی است که نیازمند دقت و حساسیت بیشتری است. گاهی این خطاها ناشی از خود ما و یا گاهی ناشی از ریجنت ها و موادی هست که برای این منظور مورد استفاده قرار می دهیم. در زیر به بررسی برخی از این خطاها و همچنین انتخاب بهترین راه حل می پردازیم.بیشترین میزان خطا در الایزا مربوط به تکنیسن است چون در حد میکرولیتری و حجم کمتر تست انجام می گیرد.  همه خطاهای الایزا مربوط به اپراتور نیست و محلول هاو همچنین موادی که در الایزا مورد استفاده قرار می گیرند گاهی باعث خطا می شوند. آلودگی سر پیپت ها و همچنین ریجنت ها با میکروارگانیسم ها یکی از این دلایل است. یکی از خطاهای رایج انتخاب طول موج اشتباه است! اگر چاهک دارای رنگ شدید یا متوسطی باشد ولی میزان OD آن کمتر از یک باشد باید طول موج بررسی شود. برای کارهای حساس الایزا بهتر است که از آب سه بار مقطر شده استفاده شود

*بعد از سی دقیقه انکوبه کردن، مقدار رنگ خیلی کم و یا اصلا قابل مشاهده نیست مشکل می تواند از سوبسترا باشد: 

1. هیدروژن پر اکسید اضافه نشده است آن را چک کنید.
2. محلول استوک هیدروژن پراکسید غیر فعال است آن را دوباره تیتر کنید.
3. بافر بلاک کننده در مرحله جذب آنتی زن اضافه شده است آن را بررسی کنید.
4. رقعت نامناسب هیدروژن پراکسیداز آن را چک کنید.

*رنگ در سراسر صفحه(پلیت)

1. کونژوگه خیلی قوی است، رقعت را بررسی کنید.
2. کونژوگه با ماده ای غیر از ماده اصلی واکنش داده است، با کنترل مناسب بررسی شود.
3. عوامل سرم در سرم حرارت داده شده، نمونه سرم را حرارت ندهید.

*رنگ تکه تکه

1. پوشش ضعیف و متغیر ریجنت با پلیت، بافر پوششی (coating buffer) و همچنین یک دستی رسوب بررسی شود.
2. وجود جباب در حین پیپت کردن، اجتناب کردن از شستشو و پیپتینگ شدید
3. صفحات معیوب یا صفحات غیر الایزا، استفاده از پلیت های مناسب و استاندارد
4. میکس ناکافی ریجنت و نمونه، اطمینان از میکس کافی نمونه.
5. رقعت ها به صورت ناقص انجام گرفته است، کالیبره کردن پیپت، دقت در پیپت کردن
6. شستشوی ناکافی، اجتناب از عدم استفاده از مواد شوینده در محلول شستشو، مطمئن شدن از عدم به دام افتادن حباب در دیواره
7. کونژوگه قوی، دوباره تیتر کنید.
8. غلظت بالای یکی از ریجنت ها، رقعت را بررسی کنید.

*گسترش رنگ با سرعت کم

1. ضعیف بودن کونژوگه، تیتر مورد بازبینی قرار بگیرذ ذوباره تیتر کنید.
2. آلودگی که باعث متوقت شدن فعالیت آنزیم می شود(مانند سدیم آزید برای پراکسیداز). از نگه دارنده های مناسب استفاده کنید.
3. دمای پائین انکوبه، مطمئن شوید که دمای مناسب است.
4. PH مناسب نیست، بررسی شود.

*خطاهای کلی غیر منتظره

1. فرمت پلیت نامناسب است، بررسی شود.
2. رقعت ها به صورت درست تهیه نشده اند.
3. خطای واضح در پروتکل، بررسی شود.
4. مقدار چشمی برابر با مقدار الایزا رید نیست، آلودگی بررسی شود، فیلتر ها چک شود، طول موج مناسب انتخاب شود.

منبع: کتاب The ELISA Guidebook

بسم رب المهدی(عج)

پاروویروس ها جزء ساده ترین ویروس های جانوری DNAدار می باشند که دارای ۳ پروتئین ساختمانی به نام های VP1 ، VP2 و VP3 می باشند. تکثیر این ویروس ها در هسته سلول میزبان صورت می گیرد و برای تکثیر نیاز دارند که سلول در فاز S از چرخه تکثیر خود باشد، این مورد به علت نیاز این ویروس ها به فاکتورها و عوامل دخیل در سنتز DNA می باشد. به همین دلیل این ویروس ها فقط در سلول های در حال تقسیم، تکثیر می یابند.

 از بین ویروس های این خانواده، یک پاروویروس به نام B19  در انسان خاصیت بیماری زایی دارد. این ویروس انتشار گسترده ای دارد و عفونت های ناشی از آن در تمامی طول سال و در تمام گروه های سنی دیده می شود ولی معمولا به صورت همه گیری های محدود و به طور عمده در کودکان ظاهر می شود. این ویروس در سال 1975 در طی غربالگری نمونه های خون از نظر آنتی ژن سطحی ویروس هپاتیت B شناسایی گردید. انتقال ویروس معمولا از طریق ترشحات تنفسی و یا از طریق تماس دست آلوده با دهان صورت می گیرد و البته راههای انتقال دیگری شامل تزریق فرآورده های خونی، انتقال از مادر به جنین نیز برای آن ذکر شده است. شیوع بیماری معمولا در فصل بهار و از طریق راههای تنفسی می باشد.

آنتی بادی ضد B19 ، برای تمام طول زندگی پایدار می ماند و در بیشتر بالغین، این آنتی بادی وجود دارد که نمایانگر تماس قبلی و احتمالا مصونیت در مقابل ویروس می باشد. این ویروس می تواند در انسان از طریق راه تنفسی، تزریق خون یا فرآورده های خونی و همچنین از مادر به جنین منتقل گردد. آلودگی انسان با ویروس B19 منجر به بروز بیماری ها و اختلالات متفاوتی می گردد، به طوری که در کودکان منجر به بیماری اریتم عفونی( Erythema Infectiosum ) می گردد که به بیماری پنجم( fifth Disease ) نیز معروف است. اریتم عفونی یک بیماری خفیف می باشد که علاوه بر تب خفیف با ظهور دانه های پوستی به صورت ماکولوپاپولر در ناحیه گونه مشخص می شود و با ظاهری شبیه گونه سیلی خورده ( slapped cheek ) شناسایی می شود. و به سرعت بر روی بازو و ساق پا نیز گسترش می یابد.

عفونت با پاروویروس B19 در بالغین، بیشتر به صورت درد مفاصل و آرتریت حاد و گاهی اوقات به همراه بثورات پوستی، مشخص می شود. در بین مفاصل بدن، مفاصل مچ دست و زانو بیشتر گرفتار می شوند. در مبتلایان به آنمی همولیتیک مزمن، عفونت منجر به ایجاد بحران آپلاستیک گذرا ( Transient aplastic crisis ) می گردد، به طوری که در این افراد با توقف موقتی ساخت گلبولهای قرمز، بحران آپلاستیک به وجود می آید. این ویروس تمایل به سلولهای پیش ساز رده اریتروئید (اریتروبلاست ها) دارد. به دنبال آلودگی سلولهای فوق با این ویروس، تعداد RBC ها رو به کاهش رفته و مقدار هموگلوبین خون محیطی، کاهش می یابد. توقف موقتی ساخت RBC فقط در بیمارانی که به آنمی همولیتیک مزمن مبتلا هستند و دوره زندگی RBC های آنها کوتاهتر از حد طبیعی است، سبب بروز بحران آپلاستیک می گردد، اما در افراد طبیعی این توقف کوتاه(معمولا 7 تا 10 روز) در اریتروپوئز، به علت طولانی بودن عمر RBC ها، منجر به ایجاد آنمی واضحی نمی گردد.

در بیماران ایمونوساپرس، عفونت با پاروویروس B19 منجر به ایجاد آنمی مزمن می گردد. این حالت احتمالا به علت عدم توانایی سیستم ایمنی در از بین بردن ویروس ایجاد می گردد، به طوری که در نتیجه حذف نشدن ویروس، عفونت مزمن، همراه با تخریب سلول های پیش ساز اریتروئیدی در مغز استخوان و آنمی مزمن خواهد بود.

عفونت در خانم های باردار، در اغلب موارد تاثیر مضری بر جنین ندارد، اما در پاره ای از موارد عفونت خانم های باردار در طی دوران حاملگی با پارو ویروس B19، می تواند منجر به هیدروپس فتالیس( Hydrops fetalis ) و مرگ جنین گردد. در این حالت معمولا جنین بر اثر آنمی شدید و نارسایی احتقانی قلب، از بین می رود.

تشخیص آزمایشگاهی

تشخیص پارو ویروس B19 ، بیشتر بر اساس تعیین آنتی بادی های اختصاصی ضد ویروس از نوع   IgG و IgM می باشد. مبتلایان به اریتم عفونی و آرتریت حاد ناشی از B19 ، معمولا آنتی بادی اختصاصی از نوع IgM را در خون خود دارند، در حالی که وجود آنتی بادی اختصاصی از نوع IgG نشانگر عفونت قدیمی با ویروس می باشد. آنتی ژن های ویروس B19 را می توان در نمونه حاصل از شستشوی حلق و بینی و یا در نمونه های بافتی جنینی و مغز استخوان، شناسایی نمود. شناسایی DNA ویروس در نمونه های بدست آمده از بیمار، به روش های هیبریدیزاسیون دات بلات ( Dot-blot hybridization ) و PCR امکان پذیر است...

نمونه سوالات کنکور در ادامه مطلب

سلام دوستان خوبید. وقت امتحانات است و همه جا سوتو کور شده مثل وبلاگ ما ... برای همه بچه های دانشجو آرزوی موفقیت داریم. بحثی که امروز می خواهم در این پست دنبال کنیم در مورد کشت سلولی ( یا همون کشت بافت Cell Culture ) هست. امروزه یکی از روش هایی که برای ایزوله کردن ویروس ها در آزمایشگاه های میکروب شناسی انجام می دهیم استفاده از محیط های کشتی است که حاوی سلول های خاص است. این محیط ها باعث می شود که ویروس ما در محیط آزمایشگاهی یا In Vitro رشد کرده و بتوانیم آن را ایزوله کنیم. شاید دانشجویان دوره کارشناسی علوم آزمایشگاهی مثل خودم تنها تئوری این مطالب را آموزش دیده اند ولی امروزه استفاده از این روش ها به امر رایجی در کشور های پیشرفته تبدیل شده است بنابراین تک تک ما باید نسبت به این روش ها آشنایی مقدماتی داشته باشیم. ویروس میکروارگانیمسی است که با نفوذ به سلول اثرات مختلفی را بر روی ماکرومولکول ها و پروتئین های سلول هدف می گذارد یکی از راه های تشخیص این ویروس ها توسط بررسی اثرات آنها بر روی سلول های محیط کشت است.  انکلزیون ها یا تغییراتی که در سطح سلول ها می دهد برای شناسایی بسیاری از ویروس ها در کشت سلولی استفاده می شود.

کشت سلولی در واقع استفاده از سلول های یوکاریوت، پروکاریوت و یا گیاهی است که برای ایزوله کردن ویروس از آن ها استفاده می کنیم. این روش برای اولین بار در سال 1907 ( اگر درست یادم مونده باشه)توسط رز هانسون مورد استفاده قرار گرفت.  نکته بسیار مهم در این کشت ها این است که باید شرایط تحت کنترل باشد و تمامی شرایط اپتیم برای سلول ها در دسترس باشد چون در اینجا بر خلاف محیط های کشت باکتریایی، محیط ما زنده است و باید مثل پرستار مراقب آنها باشیم. امروزه بیشتر از محیط های کشتی که از سلول های جانوران مشتق شده است استفاده می شود و در کشور ما هم در دسترس هستند مثلا DMEM , EMEM. به طور خلاصه از سه نوع سلول ( بر اساس شکل و ظاهر) در محیط های کشت سلولی استفاده می کنیم:

1. سلول های شبیه اپی تلیال( Epithelial-like cells)
2. سلول های شبیه  لنفوبلاستی( Lymphoblast-like cells)
3. سلول های شبیه فیبروبلاستی( Fibroblastic)

قبل از معرفی این سلول ها دو تکنیکی که در کشت سلولی استفاده می شود را باید بهتون معرفی کنیم:

یکی استفاده از سلول های چسبنده (Adherent Cell ) است. به زبان ساده نحوه کشت در این تکنیک بدین صورت است که سلول ها به هم چسبیده هستند و به راحتی نمی شود آنها را پاساژ ( ساب کالچر- Sub culture ) داد چون این سلول ها در داخل فلاسک های کشت ما متصل هستند و زمانی که می خواهیم آنها را پاساژ دهیم( زمانی که سلول های ما در فلاسک به اصطلاح سرریز می شوند) باید سلول ها را از هم جدا کنیم ولی این به سختی انجام می گیرد. در دهه های گذشته یکی از پیشرفت های کشت سلولی همین مشکل ما را حل کرده است. بیولوژیست ها آنزیمی هایی مانند کلاژناز متصل به EDTA را تولید کرده اند که به وسیله آن می توانیم این سلول ها را از هم جدا کنیم از طریق جداسازی سلول ها از طریق هضم کردن ماتریکس بین سلولی. پس این روش متصل به سطح هست. راستی برای شستشوی سلول ها هم در کشت سلولی از محلول PBS استفاده می کنیم.

روش دیگر استفاده از سوسپانسیون است، این روش بر خلاف روش بالایی به راحتی پاساژ داده می شود چون مایع هست و نیازی به این همه سختی ندارد. در این روش یک سوم فلاسک را خالی می کنیم و سپس با محلول محیط اولیه خودمان ( که قبلا گرم شده است) آن را پر می کنیم. به همینراحتی می توان آن را پاساژ داد.

سلول های اپی تلیال و سلول های فیبروبلاست  ( مثلا سلول های اپی تلیال کلیه میمون سبز آفریقایی که بهش Vero می گوئیم) در تکنیک اول یا همون سلول های چسبنده استفاده می شود در حالیکه از لنفوبلاست های معمولا در سوسپانسیون استفاده می شود.

از هر روشی که استفاده می کنیم به علت افزایش سلول ها و کاهش منابع غذایی باید سلول ها را ساب کالچر یا همان پاساژ داد. بدین ترتیب سلول ها در چرخه رشد خود باقی می مانند و نمی میرند. بعد از پاساژ دادن های مختلف بالاخره سلول های ما به دست می آید که به آنها لاین سلولی می گویند. در واقع ما در این لاین ها ویروس ها ( یا هر چیز دیگه که نیازش داریم ) را کشت می دهیم. این لاین های سلولی به صورت تجاری در دسترس هستند وانواع مختلفی دارند. با توجه به نوع سلولی که به آن نیاز داریم می توانیم از آنها استفاده کنیم. این چند نکته مواردی بود که الان تو ذهنم بود و براتون پست کردم اگر فرصت شد تو ادامه بیشتر در این زمینه بحث خواهیک کرد. از شما هم درخواست داریم که تجربیات خودتان در این زمینه را در اختیار بچه های علوم آزمایشگاهی قرار بدهید تا ما تازه وارد ها بیشتر با دنیای زیبای رشته خودمون آشنا شویم.

 بسم رب المهدی(عج)

ایلنا نوشت: رئیس مرکز مدیریت بیماری‌های واگیر با بیان این خبر گفت: از ۴ نفر مبتلا به تب کنگو در مشهد، ۲ نفر از بیمارستان مرخص شدند و ۲ نفرهمچنان دربیمارستان بستری هستند.

 محمد مهدی گویا گفت: حال عمومی هر ۲ نفرمبتلا به تب کنگو که در بیمارستان امام رضا (ع) مشهد بستری هستند بسیارخوب است و طی روزهای آینده مرخص می‌شوند.

 وی با تاکید بر بهبودی کامل حال هر ۴ نفر مبتلا به تب کریمه کنگو در مشهد افزود: از ۶ مورد گزارش ابتلا به بیماری تب کریمه کنگو در مشهد ۲ نفر از مبتلایان به علت شدت بیماری فوت کردند و ۴ نفر دیگر نیز پس از انجام مراقبت‌های ویژه و درمانی لازم بهبودی کامل یافتند.

 گویا خاطرنشان کرد: مورد دیگری در زمینه ابتلا به بیماری تب کریمه کنگو گزارش نشده است.

 رئیس مرکز مدیریت بیماری‌های واگیر با بیان اینکه بیماری تب کریمه کنگو از طریق خوردن گوشت منتقل نمی‌شود، خاطر نشان کرد: این بیماری یک عفونت ویروسی است که از طریق تماس با حیوان آلوده، ذبح حیوان آلوده و تماس با امعاء و احشاء حیوان آلوده در صورت عدم رعایت نکات بهداشتی به انسان منتقل می‌شود.

 گویا افزود: همچنین این بیماری از طریق گزش کنه‌ای که روی بدن دام بیمار وجود دارد، قابل انتقال به انسان است و در صورت ابتلا انسان به این بیماری، دیگر افرادی که در حین مراقبت درمانی با خون و ترشحات بدن فرد بیمار در تماس باشند و نکات بهداشتی را رعایت نکرده باشند، ممکن است به این بیماری مبتلا شوند.

 اطلاعات بیشتر در مورد بیماری در ادامه مطلب

ویروس ها را هم مثل باکتری ها میتوانیم در ازمایشگاه خودمان کشت دهیم و انها را ایزوله کرده و یا برای اهداف درمانی استفاده کنیم. از انجا که ویروس ها ریزموجودات داخل سلولی اجباری هستند بنابراین سلول زنده در ازمایشگاه، برای رشد انها نیاز داریم.لاین های سلولی مختلفی برای کشت سلول ها در ازمایشگاه توسعه یافته است. یک لاین سلولی برای کشت کافی نیست. هر سلول خاص گیرنده ویژه ای در سطح سلول را نیاز دارد تا بتواند به سلول متصل شود و تقسیم نخستین را انجام دهد. حضور گیرنده خاص در سطح سلول تعیین می کند که چه نوع ویروسی سلول را آلوده کند به این اصطلاحا "viral cell tropism"می گویند. به این علت لاین های سلولی مختلف برای کشت ویروس ها و تشخیص انها در ازمایشگاه های خودمان باید نگه داری شوند. مشکل دیگر در کشت ویروس ها نگه داری این کشتها زنده به مدت زیاد دز ازمایشگاه است تا ویروس ها به طور مناسب رشد کنند. سوسپانسیونی از سلول ها در محیط رشد(متشکل از یک بافر به همراه سرم گوساله که منبع پروتئین و اسید امینه است و آنتی بیوتیک برای جلوگیری از رشد پیش از حد باکتری ها ) در داخل ظرف یا فلاسک/تیوب پلاستیکی قرار میگیرد سلول ها به اطراف ظرف متصل می شوند و تا زمانی که سرریز شوند رشد می کنند. نمونه بیمار بعدا اضافه می شود و در گرمخانه 37 درجه  برای رشد ویروس ها انکوبه می شوند (ویروس های تنفسی در دمای 33 درجه). رشد تیوب ها را  هر روز از نظر رشد ویروس ها بررسی می کنیم. اگر ویروس در کشت ها وجود داشته باشد سلول ها را خواهد کشت. با توجه به لاین سلولی و رشد سلولی در ان، کشتن سلول ها در محیط کشت همراه با ظاهر تیپیکی خاصی در ورقه سلولی هست. به این حالت اثر سایتوپاتیک یا CPE می گویند. یک ویروس شناس حرفه ای می تواند بر اساس همین خاصیت سایتوپاتیک ویروس ها را تشخیص دهد ولی تست های تائیدی مانند میکروسکوپ الکترونی، ایمونوفلورسنس ، خنثی سازی و .. نیاز است. محیط های کشت میتوانند از منیع انسانی و یا غیرانسانی باشند ولی به طور کلی به دو دسته زیر تقسیم بندی می شوند:

• پیوسته:سلول های جاودانه ای هستند که از سلول های توموری منشا گرفته اند. مثال:HeLa (human cervical cancer cell line), hep2 and Graham 293 cells (transformed human epithelial cell line
• اولیه: همان طور که از اسم ان مشخص است برای یک و یا چند چرخه محدود رشد استفاده می شود. این محیط ها حساس به عفونت با ویروس هستند و برخی ویروس ها مانند انفولانزا و VZV, CMV باید در انها کشت داده شوند. مثال:areMRC5 (human lung fibroblast cell line), PMK (primary monkey kidney cell line)

کشت ویروسیک روش بسیار حساسی است و نیازمند تکنیک های مختلفی است. بررسی نتایج می تواند چندین هفته طول بکشد. نمونه ها باید هر چه سریع تر به محیط کشت وارد شوند. برخی از ویروس ها مانند: hepatitis viruses, papilloma viruses, parvovirus B19, rotavirus و norovirus در محیط کشت رشد نمی کنند و برخی از ویروس ها مانند EBV and HIV نیازمند محیط کشت اختصاصی هستند و نباید در محیط های معمولی کشت داده شوند.

^{منبع: Clinical and Diagnostic Virology}