علوم آزمایشگاهی | Lab sciences

|الایزا به علت حساسیت زیادی که به محیط و هم چنین خطاهای کاربری دارد تستی است که نیازمند دقت و حساسیت بیشتری است. گاهی این خطاها ناشی از خود ما و یا گاهی ناشی از ریجنت ها و موادی هست که برای این منظور مورد استفاده قرار می دهیم. در زیر به بررسی برخی از این خطاها و همچنین انتخاب بهترین راه حل می پردازیم.بیشترین میزان خطا در الایزا مربوط به تکنیسن است چون در حد میکرولیتری و حجم کمتر تست انجام می گیرد.  همه خطاهای الایزا مربوط به اپراتور نیست و محلول هاو همچنین موادی که در الایزا مورد استفاده قرار می گیرند گاهی باعث خطا می شوند. آلودگی سر پیپت ها و همچنین ریجنت ها با میکروارگانیسم ها یکی از این دلایل است. یکی از خطاهای رایج انتخاب طول موج اشتباه است! اگر چاهک دارای رنگ شدید یا متوسطی باشد ولی میزان OD آن کمتر از یک باشد باید طول موج بررسی شود. برای کارهای حساس الایزا بهتر است که از آب سه بار مقطر شده استفاده شود

*بعد از سی دقیقه انکوبه کردن، مقدار رنگ خیلی کم و یا اصلا قابل مشاهده نیست مشکل می تواند از سوبسترا باشد: 

1. هیدروژن پر اکسید اضافه نشده است آن را چک کنید.
2. محلول استوک هیدروژن پراکسید غیر فعال است آن را دوباره تیتر کنید.
3. بافر بلاک کننده در مرحله جذب آنتی زن اضافه شده است آن را بررسی کنید.
4. رقعت نامناسب هیدروژن پراکسیداز آن را چک کنید.

*رنگ در سراسر صفحه(پلیت)

1. کونژوگه خیلی قوی است، رقعت را بررسی کنید.
2. کونژوگه با ماده ای غیر از ماده اصلی واکنش داده است، با کنترل مناسب بررسی شود.
3. عوامل سرم در سرم حرارت داده شده، نمونه سرم را حرارت ندهید.

*رنگ تکه تکه

1. پوشش ضعیف و متغیر ریجنت با پلیت، بافر پوششی (coating buffer) و همچنین یک دستی رسوب بررسی شود.
2. وجود جباب در حین پیپت کردن، اجتناب کردن از شستشو و پیپتینگ شدید
3. صفحات معیوب یا صفحات غیر الایزا، استفاده از پلیت های مناسب و استاندارد
4. میکس ناکافی ریجنت و نمونه، اطمینان از میکس کافی نمونه.
5. رقعت ها به صورت ناقص انجام گرفته است، کالیبره کردن پیپت، دقت در پیپت کردن
6. شستشوی ناکافی، اجتناب از عدم استفاده از مواد شوینده در محلول شستشو، مطمئن شدن از عدم به دام افتادن حباب در دیواره
7. کونژوگه قوی، دوباره تیتر کنید.
8. غلظت بالای یکی از ریجنت ها، رقعت را بررسی کنید.

*گسترش رنگ با سرعت کم

1. ضعیف بودن کونژوگه، تیتر مورد بازبینی قرار بگیرذ ذوباره تیتر کنید.
2. آلودگی که باعث متوقت شدن فعالیت آنزیم می شود(مانند سدیم آزید برای پراکسیداز). از نگه دارنده های مناسب استفاده کنید.
3. دمای پائین انکوبه، مطمئن شوید که دمای مناسب است.
4. PH مناسب نیست، بررسی شود.

*خطاهای کلی غیر منتظره

1. فرمت پلیت نامناسب است، بررسی شود.
2. رقعت ها به صورت درست تهیه نشده اند.
3. خطای واضح در پروتکل، بررسی شود.
4. مقدار چشمی برابر با مقدار الایزا رید نیست، آلودگی بررسی شود، فیلتر ها چک شود، طول موج مناسب انتخاب شود.

منبع: کتاب The ELISA Guidebook

سلام دوستان خوبید. وقت امتحانات است و همه جا سوتو کور شده مثل وبلاگ ما ... برای همه بچه های دانشجو آرزوی موفقیت داریم. بحثی که امروز می خواهم در این پست دنبال کنیم در مورد کشت سلولی ( یا همون کشت بافت Cell Culture ) هست. امروزه یکی از روش هایی که برای ایزوله کردن ویروس ها در آزمایشگاه های میکروب شناسی انجام می دهیم استفاده از محیط های کشتی است که حاوی سلول های خاص است. این محیط ها باعث می شود که ویروس ما در محیط آزمایشگاهی یا In Vitro رشد کرده و بتوانیم آن را ایزوله کنیم. شاید دانشجویان دوره کارشناسی علوم آزمایشگاهی مثل خودم تنها تئوری این مطالب را آموزش دیده اند ولی امروزه استفاده از این روش ها به امر رایجی در کشور های پیشرفته تبدیل شده است بنابراین تک تک ما باید نسبت به این روش ها آشنایی مقدماتی داشته باشیم. ویروس میکروارگانیمسی است که با نفوذ به سلول اثرات مختلفی را بر روی ماکرومولکول ها و پروتئین های سلول هدف می گذارد یکی از راه های تشخیص این ویروس ها توسط بررسی اثرات آنها بر روی سلول های محیط کشت است.  انکلزیون ها یا تغییراتی که در سطح سلول ها می دهد برای شناسایی بسیاری از ویروس ها در کشت سلولی استفاده می شود.

کشت سلولی در واقع استفاده از سلول های یوکاریوت، پروکاریوت و یا گیاهی است که برای ایزوله کردن ویروس از آن ها استفاده می کنیم. این روش برای اولین بار در سال 1907 ( اگر درست یادم مونده باشه)توسط رز هانسون مورد استفاده قرار گرفت.  نکته بسیار مهم در این کشت ها این است که باید شرایط تحت کنترل باشد و تمامی شرایط اپتیم برای سلول ها در دسترس باشد چون در اینجا بر خلاف محیط های کشت باکتریایی، محیط ما زنده است و باید مثل پرستار مراقب آنها باشیم. امروزه بیشتر از محیط های کشتی که از سلول های جانوران مشتق شده است استفاده می شود و در کشور ما هم در دسترس هستند مثلا DMEM , EMEM. به طور خلاصه از سه نوع سلول ( بر اساس شکل و ظاهر) در محیط های کشت سلولی استفاده می کنیم:

1. سلول های شبیه اپی تلیال( Epithelial-like cells)
2. سلول های شبیه  لنفوبلاستی( Lymphoblast-like cells)
3. سلول های شبیه فیبروبلاستی( Fibroblastic)

قبل از معرفی این سلول ها دو تکنیکی که در کشت سلولی استفاده می شود را باید بهتون معرفی کنیم:

یکی استفاده از سلول های چسبنده (Adherent Cell ) است. به زبان ساده نحوه کشت در این تکنیک بدین صورت است که سلول ها به هم چسبیده هستند و به راحتی نمی شود آنها را پاساژ ( ساب کالچر- Sub culture ) داد چون این سلول ها در داخل فلاسک های کشت ما متصل هستند و زمانی که می خواهیم آنها را پاساژ دهیم( زمانی که سلول های ما در فلاسک به اصطلاح سرریز می شوند) باید سلول ها را از هم جدا کنیم ولی این به سختی انجام می گیرد. در دهه های گذشته یکی از پیشرفت های کشت سلولی همین مشکل ما را حل کرده است. بیولوژیست ها آنزیمی هایی مانند کلاژناز متصل به EDTA را تولید کرده اند که به وسیله آن می توانیم این سلول ها را از هم جدا کنیم از طریق جداسازی سلول ها از طریق هضم کردن ماتریکس بین سلولی. پس این روش متصل به سطح هست. راستی برای شستشوی سلول ها هم در کشت سلولی از محلول PBS استفاده می کنیم.

روش دیگر استفاده از سوسپانسیون است، این روش بر خلاف روش بالایی به راحتی پاساژ داده می شود چون مایع هست و نیازی به این همه سختی ندارد. در این روش یک سوم فلاسک را خالی می کنیم و سپس با محلول محیط اولیه خودمان ( که قبلا گرم شده است) آن را پر می کنیم. به همینراحتی می توان آن را پاساژ داد.

سلول های اپی تلیال و سلول های فیبروبلاست  ( مثلا سلول های اپی تلیال کلیه میمون سبز آفریقایی که بهش Vero می گوئیم) در تکنیک اول یا همون سلول های چسبنده استفاده می شود در حالیکه از لنفوبلاست های معمولا در سوسپانسیون استفاده می شود.

از هر روشی که استفاده می کنیم به علت افزایش سلول ها و کاهش منابع غذایی باید سلول ها را ساب کالچر یا همان پاساژ داد. بدین ترتیب سلول ها در چرخه رشد خود باقی می مانند و نمی میرند. بعد از پاساژ دادن های مختلف بالاخره سلول های ما به دست می آید که به آنها لاین سلولی می گویند. در واقع ما در این لاین ها ویروس ها ( یا هر چیز دیگه که نیازش داریم ) را کشت می دهیم. این لاین های سلولی به صورت تجاری در دسترس هستند وانواع مختلفی دارند. با توجه به نوع سلولی که به آن نیاز داریم می توانیم از آنها استفاده کنیم. این چند نکته مواردی بود که الان تو ذهنم بود و براتون پست کردم اگر فرصت شد تو ادامه بیشتر در این زمینه بحث خواهیک کرد. از شما هم درخواست داریم که تجربیات خودتان در این زمینه را در اختیار بچه های علوم آزمایشگاهی قرار بدهید تا ما تازه وارد ها بیشتر با دنیای زیبای رشته خودمون آشنا شویم.

Cellular and Molecular Immunology, 5th Edition

کتاب ایمونولوژی ابوالعباس کتاب رفرانس معرفی شده برای بسیاری از گرایش های است که واحد ایمنی را باید پاس کنند و یا امتحان بدهند . این کتاب به زبان فارسی هم ترجمه شده است . کتابی که برای دانلود معرفی شده است به صورت کاملا رنگی و با فرمت CHM است . تمامی مباحث تئوری ایمنی شناسی در 5 بخش معرفی شده است . ویرایش 5 کتاب در وبلاگ معرفی شده است در حالی که ویرایش 6 این کتاب هم روانه بازار شده است و اگر لینکی ازش پیدا کردیم در وبلاگ معرفی خواهیم کرد .

• برای دانلود کلیک کنید | Mediafire  (حجم کتاب 47 مگابایت است . )
• برای دیدن لیست کل ایبوک های قرار داده شده در وبلاگ ، به اینجا بروید .

 

مواد شديدا" قابل اشتعال شامل مواد شيميايي است كه نقطه اشتعال آن حدود 38 درجه سانتيگراد است و اين مواد از نظر كنترل آتش سوزي در آزمايشگاه بايد مورد دقت قرار گيرند.

اتيل اتر

     اين ماده كه به نام هاي اتر, اتر بيهوشي, دي اتيل اتر, اتيل دي اكسيد, سولفوريك اتر, وينيك اتر و اتوكسي اتان معروف است, يك ماده فراري است كه مي تواند بزودي در تمام محيط آزمايشگاه پراكنده شود. ماده اي شديدا قابل اشتعال كه مي تواند ماده قابل انفجار پراكسيد درست كند. نقطه اشتعال پايين آن و نقطه شعله ور شدن پائين, آن را بصورت يكي از مواد خطرناك درآورده است.

توليد ناگهاني ماده قابل انفجار پراكسيد براي مصرف كنندگان اتر كه داراي تجربه كافي نيستند خطرات فراواني بوجود مي آورد. بنابراين بايد به نكات حفاظتي خاصي توجه كرد :

• بلافاصله بعد از دريافت قوطي اتر, روي آن تاريخ بگذاريد.
• قوطي هايي كه بيش از يك سال از تاريخ دريافت آن گذشته, باز نكنيد زيرا ممكن است در قوطي هاي مهر و موم شده, فرم پراكسيد آن تشكيل شود و هنگام باز كردن موجب انفجار گردد.
• همواره مقدار كم و مورد نياز بايد سفارش داد كه از هدر رفتن پول جلوگيري شود.
• پس از باز كردن قوطي اتر بايد مجددا روي آن تاريخ گذاشت, از مصرف اتر قوطي هايي كه تاريخ مصرف آنها بيش از يك ماه گذشته باشد بايد خودداري شود, همواره قوطي هاي كوچك بايد سفارش داد.
• شيشه ها و قوطي هاي محتوي اتر را در محل خنك در كف اتاق قرار دهيد و يا در قفسه و گنجه هايي بگذاريد كه درب آن زياد بسته نباشد.
• هيچگاه قوطي هاي باز شده را در يخچال نگذاريد زيرا اتر در هواي يخچال نيز تبديل به بخار مي شود. اگر پراكسيد تشكيل شود, باز كردن ناگهاني درب يخچال ممكن است سبب انفجار گردد. وجود بخارهاي اتر در يخچال بسته ممكن است با موتور الكتريكي يخچال تماس يافته حالت انفجار بوجود آورد.
• قوطي هاي باز نشده اتر را مي توان در كنار قوطي هاي باز شده در كف اتاق و يا در قفسه اي نزديك به كف اتاق قرار داد.
• قبل از دور ريختن شيشه هاي خالي و يا تقريبا خالي بهتر است آنها را زير شير آب قرار داده و با مقدار كافي و زياد آب شست. هيچگاه مقدار زيادي اتر را در فاضلاب نبايد خالي كرد و در اين موارد بايد با مسئولان بهداشت حرفه اي مشورت كرد.
• درصورت عدم اطمينان از مدت زمان و تاريخ انقضاي قوطي ها نبايد آنها را باز كرد زيرا ممكن است پراكسيد تشكيل شده باعث انفجار گردد.
• تمام قوطي هاي تاريخ گذشته بايد از طريق مسئول بهداشت حرفه اي دور ريخته شوند.

مواد قابل اشتعالي كه در آزمايشگاه مصرف بيشتري دارند بترتيب درجه خطر آتش سوزي, شعله ور شدن و خطرات بهداشتي عبارتند از:

 " اتر, استالدئيد, استن, گاز استيلن, بنزن, بوتانول, سيكلوهگزان, دي اتيل آمين, اتيل استات, اتيل الكل, دي كلرواتيلن, هپتان, هگزان, هيدروكسيل آمين, ايزوپروپيل الكل, ايزواكتان, متانول, تولوئن و گزيلن "

 

 

سلام . مدت های بود که کتابی را در وبلاگ برای دانلود قرار نداده بودیم . کتاب ایمونولوژی کوبای یکی از منابع ایمنی شناسی است که در ۴ بخش به بررسی سلول های ایمنی ، سیستم ایمنی و سایر مباحث مربوط به این زمینه می پردازد .

•  برای دانلود کلیک کنید .(حجم: ۲۰ مگابایت)
• برای دیدن لیست کل ایبوک های قرار داده شده در وبلاگ ، به اینجا بروید . 

خطرات آزمايشگاه هاي ميكروبيولوژي

---

"از زماني كه ميكروبيولوژي بصورت يك علم درآمده است, حوادث ناشي از باكتري هاي بيماريزا در كاركنان بخش هاي مختلف پزشكي گزارش شده است. بررسي دقيق اين موارد, نشان مي دهد كه متأسفانه اغلب اين حوادث بعلت سهل انگاري كاركنان و عدم رعايت موازين و اصول حفاظت و ايمني بوده است."

---

كاركنان آزمايشگاه ها و بيمارستانها و مراكز پزشكي بايد دقيقا" راههاي سرايت ميكروارگانيسم ها و نحوه كار كردن با آنها و نحوه تماس با بيماران و نمونه هاي آزمايشي را بياموزند تا از آلودگي هاي محيط و  آلودگي هاي فردي جلوگيري شود.حفاظت از عفونت هاي ميكروبيولوژي در ساده ترين شكل خود مستقيما" بستگي به كنترل دقيق عوامل ميكروبي بخصوص به عوامل محيطي خاص دارد. آشنايي با اين روش هاي كنترل زماني كه در يك آزمايشگاه ميكروب هاي بيماريزا كشت مي شود و يا حيوانات آزمايشگاهي مورد بررسي هاي تحقيقاتي با اين ميكروب ها قرار مي گيرند, در جلوگيري از آلوده شدن كاركنان كمك مي كند.

سانتريفيوژ آزمايشگاهي (laboratory centrifuge ) ، يكي از ابزارات آزمايشگاه تشخيص طبي هست كه با استفاده از نيروي موتور خود ، نمونه مايع را با سرعت بسيار زيادي به چرخش درميارند .بسته به اندازه و ظرفيت نمونه سانتريفيوژهاي مختلفي وجود دارد . مانند تمام سانتريفيوژ ها ، سانتريفيوژهاي پزشكي هم توسط اصل رسوبي مواد در سرعت بالا كار مي كنند كه در ان شتاب جاذبه اي مركزي ، باعث جدا شدن مواد به دو نوع ناحيه كم و پر تراكم مي شود .

در ادامه مطلب با عملكرد ، انواع ، تاريخچه ، طراحي ، تيوب ها و  اصول ايمني كار با دستگاه مربوط به سانتريفيوژ با هم بحث مي كنيم .

مهم ترين نقش كمپلمان دفاع در برابر عوامل ميكروبي و از بين بردن آنهاست. پروتئين هاي شكسته شده و فعال كمپلمان، التهاب ايجاد مي كنند كه اين مكانيزم به نوبه خود در از بين بردن عوامل بيماري زا نقش عمده اي دارند فاكتور هاي آنافيلاتوكسين (به ماده سمي در آنافيلاكسي گويند. آنافيلاكسي نيز زياد شدن حساسيت بدن نسبت به يك پروتئين خارجي يا ماده ديگري كه بدن قبلاً با آن حساس شده است مي باشد و شيميوتاكتيك (ماده جاذب شيميايي) هر يك عامل يكسري از واكنش هاي ثالنوي هستند كه با همكاري سلول هاي سفيد خون يعني سلول هاي ماست سل، نوتروفيل، مونوسيت و ماكروفاژ انجام مي شود؛ بنابراين، اگر فردي به طور مادرزادي فاقد برخي از پروتئين هاي سيستم كمپلمان باشد، در برابر عفونت بسيار حساس مي شود. از طرف ديگر، اگر سيستم كمپلمان از كنترل خارج شده يا به طور مرتب فعال شود موجب بروز ضايعات التهابي و تخريب بافتي مي شود. ضايعاتي كه در اثر بيماري هاي خود ايمني به وجود مي آيد در نتيجه تشكيل كمپلكس ايمني و فعال شدن سيستم كمپلمان است. اندازه گيري مقدار كمپلمان در موارد زير انجام مي شود:

1-بيماري هايي كه مصرزف كمپلمان به دليل تشكيل كمپلكس ايمني بالا است. مانند بيماري هاي روماتيسمي .

۲-بيماريهايي كه در آنها سنتز كمپلمان بر دلايل نفس ژنتيكي و مادرزادي يا بيماريهاي ديگر متوقف مي شود يا كاهش مي يابد.

در نتيجه اين نقص، عفونت هاي مكرر بروز مي كند. به طور كلي اندازه گيري مقادير C3 و C4 به طور مرتب براي دنبال كردن وضعيت بيمار مبتلا به بيماريهاي ايمونولوژيكي بسيار مفيد است. تست CH50 به عنوان تست اوليه براي تشخيص بيماراني كه به طور مكرر به عفونت مبتلا مي شوند و احتمالاً فاقد يك يا چند عدد از پروتئين هاي سيستم كمپلمان به طور مادرزادي هستند بسيار مفيد است.

از آنجا كه زنجيره‌هاي تازه ساخته شده خود مكمل پرايمرها است، اين چرخه مي‌تواند پس از يك مرحله واسرشته شدن زنجيره‌هاي ‏DNA‏ از هم تكرار شود. به عبارتي ‏PCR‏ روشي است براي يك برنامه دوره‌اي مشتمل براي تكرار گرم و سرد كردن و ‏DNA‏ به‌كمك يك آنزيم ‏DNA‏ پليمراز مقاوم به گرما و يك جفت پرايمر تحت تكثير انتخابي قرار مي‌گيرد و از طريق اين روش ‏DNA‏ به صورت تصاعد هندسي زياد مي‌شود. امروزه روش ‏PCR‏ جايگاه بسيار مهمي را در جنبه‌هاي مختلف مهندسي ژنتيك، بيولوژي مولكولي، ميكروب‌شناسي تشخيصي تشخيص سرطان و بيماري‌هاي ژنتيك، تشخيص هويت، جرم شناسي (پزشكي قانوني جهت تشخيص منشأ نمونه اسپرم، خون و ...) تعيين ترادف، باستان‌شناسي، مطالعات تكاملي موجودات و ... پيدا كرده است. كاربرد بيشتر و دقيق‌تر تكنيك ‏PCR‏ در تشخيص، روش‌هاي تغيير يافته‌اي از آن به وجود آمده است كه به تعدادي از آنها اشاره مي‌شود.

مالتيپلكس پي سي آر (‏Multiplex-PCR‏)‏
‏ يكي از روش‌هاي تغييريافته ‏PCR‏ است كه در آن تنها يك جايگاه ژني مورد بررسي قرار مي‌گيرد، با استفاده از پرايمرهاي مختلف مي‌توان چندين جايگاه را مورد بررسي قرار داد و از چندين جفت پرايمر اختصاصي جهت تكثير استفاده مي‌شود. كاربردهاي اين روش مي‌تواند شامل موارد زير باشد: ‏
‏1) بخش‌هاي بزرگي از يك ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست‌وجوي تغييرات مي‌تواند بررسي شود. براي مثال كشف نقص‌ها در بيماري ديستروفي عضلاني روشن يا كشف بخش‌هاي مختلف ‏IS6110‎‏ و ‏IS986‎‏ در مايكروباكتريوم توبر كلوزيس عامل بيماري سل، ‏
‏2) بخش‌هاي غيرمربوط به هم در ژنوم هدف مي‌تواند مورد آزمايش واقع شود و‏
‏3) مي‌توان از طريق اين روش با پرايمرهاي مختلف به جست‌وجوي عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسايي عوامل شايع مننژيت. اين روش بيشتر براي شناسايي جايگاه‌هايي از ژن‌ها به كار مي‌رود كه انواع زيادي از جهش در آنها به وقوع مي‌پيوندد.

..لطفا به ادامه مطلب توجه بفرمایید..

 پروتئین بنس- جونز متشکل از دایمرهایی از زنجیره های سبک کاپا یا لاندا ایمنوگلوبین ها است.این پروتئین در ابتدا به وسیله هنری جونز در سال 1847 به علت خواص قابلیت انحلال غیر معمول آن شناخته شده است.
این پروتئین وقتی تا  `c60-40 حرارت داده شود رسوب می کند اما وقتی جوشانیده می شود دوباره محلول می گردد.وزن مولکولی این پروتئین کوچک است،44000 دالتون، بنابراین از داخل گلومرولهای سالم به آسانی فیلتره می گردد.
برای درک پروسه ترشح زنجیره های سبک در ادرار لازم است به منشا تولید این زنجیره ها پی ببریم.در بیماریهای اساسی یک کلون بدخیم از ایمنوسیتهای تولید کننده ایمنوگلوبولین تشکیل می گردد. تمامی سلولها در کلون نتیجه پرولیفراسیون یک سلول منفرد هستندو بنابراین دارای خواص یکسانی می باشند.