علوم آزمایشگاهی | Lab sciences

محيط هاي كشت

 الف : محيط كشت مايع 

 آبگوشت  (Broth) ، انواع محلولهاي قندي مثل گلوكزبرات .

ب : محيط هاي جامد : Agar

 آگار يك پلي ساكاريد است . پلي ساكاريد كمپلكسي است كه باكتري ها مي توانند آن را تجزيه كنند . ( سفت كننده است ) .

• ما به طور معمولي محيط هاي جامد را داخل پليت تهيه مي كنيم ( يك تعدادي داخل لوله ) محيط هاي مايع هميشه داخل لوله تهيه مي شوند .
•  

ج : حالت نيمه جامد

آگار را به ميزان كم دارد حالت ژل مانند . از اين محيط ها عمدتا جهت بررسي فاكتور حركت در باكتريها استفاده مي كنيم و در لوله هم تهيه مي شوند .

محيط‌هاي كشت مصنوعي

• محيط‌هاي كشت غني كننده : مثالي از اين نوع محيط كشت آبگوشت سلنيت مي‌باشد، كه رشد تعدد كم پاتوژنهاي مدفوعي را تقويت  و رشد تعداد زياد ارگانيسم‌هاي فلور نرمال را سركوب مي‌كند.

• محيط‌هاي نگهدارنده (Supportive media): اين محيط‌ها حاوي مواد مغذي بوده كه بدون دادن امتياز به هر گونه ارگانيسم خاص جهت رشد بر روي محيط كشت، به تمام ارگانيسم‌هاي غير سخت رشد اجازه مي‌دهد كه با سرعت طبيعي رشد نمايند. مثالهائي از اين دسته از محيط‌هاي كشت نوترينت آگار و BHI آگار مي‌باشند.

• محيط‌هاي انتخابي (Selective media):محيط هائي وجود دارند كه داراي يك مادة مهار كننده رشد مي‌باشند. اين موارد رشد تمام ارگانيسم‌ها بجز ارگانيسم مورد نظر را مهار مي‌كنند.  مانند محيط كشت فنيل اتيل الكل آگار PEA (Phenylethyl  alcohol agar)

• محيط‌هاي افتراقي (differential media):در اين محيط‌ها فاكتور يا فاكتورهاي استفاده شده باعث تمايز كلني ارگانيسم هائي كه داراي خواص متابوليك معين يا خصوصيات مورفولوژيك مشخص در محيط‌هاي كشت هستند از آنهائي كه خصوصيات متفاوت تري دارند، مي‌گردد. مانند آگار خوندار گوسفند 

استريل‌سازي محيط كشت در آزمايشگاه ميكروب‌شناسي

الف) محيط‌هاي مصنوعي دهيدراته كه بايستي در اتوكلاو استريل شوند.

• محيط را هميشه بايد در ظرف شيشه اي تميز كه با آب مقطر يا آب ديونيزه آبكشي شده باشد تهيه نمود. 

ب) ساير روشهاي استريليزاسيون 

محيط هائي كه داراي سرم يا پروتئين‌هاي مشخصي هستند را اغلب به طريق قوام‌آوري (inspissation) استريل مي‌كنند. در اين روش استريليزاسيون متناوب، محيط‌ها در محفظه‌اي كه بطور مداوم بخار آب در آن جريان دارد بمدت 30 دقيقه و طي چندين روز قرار داده مي‌شوند. آگار لوفلر و آگار لونشتين – جانسون بدين طريق تهيه مي‌گردند. محيط‌هاي حساس را مي‌توان بوسيلة قرار دادن فلاسكها در محفظه‌اي كه بخار در آن بطور فعال جريان دارد استريل نمود. اين محفظه كه استريل كننده بخار آرنولد ناميده مي‌شود، اغلب جهت ذوب كردن مجدد محيط هائي كه از قبل تهيه شده و ريختن آنها در پليت و سفت شدن آنها مورد استفاده قرار مي‌گيرد.

بيشتر بيمارستانها از روش استريليزاسيون بوسيلة گاز (gas sterilization) جهت استريل كردن وسايل و تجهيزات استفاده مي‌كنند. در اين روش از اكسيد اتيلن (Ethylene oxide-Eto) جهت از بين بردن باكتريها و اسپورها استفاده مي‌شود.

شرايط لازم جهت رشد پاتوژنها

به منظور تكثير باكتريها و قارچها بر روي محيط‌هاي مصنوعي، بايد مواد مغذي لازم، درجه حرارت مناسب، رطوبت كافي در محيط و در اتمسفر، اتمسفر گازي مناسب، غلظت مناسب نمك و PH مناسب، را در دسترس آنها قرار داده و نبايد فاكتورهاي ممانعت كننده رشد (مانند ساير باكتريها يا قارچها يا ساير تركيبات صناعي كه از رشد آنها ممانعت بعمل مي‌آورد) در محيط وجود داشته باشد.

 برقراري شرايط اتمسفري لازم جهت رشد پاتوژنها بجز باكتريهاي بيهوازي

ارگانيسم‌هاي پاتوژن يا هوازي هستند، از اكسيژن به عنوان پذيرنده نهائي الكترون استفاده مي‌كنند و رشد خوبي در اتمسفر هواي اتاق دارند، يا بيهوازي هستند كه قادر به تحمل اكسيژن محيط نيستند و يا ميكروآئروفيل هستند، رشد بهتري در فشار كم اكسيژن دارند. ارگانيسم‌هاي هوازي را مي‌توان بدون مشكل زياد در اتمسفر اتاق انكوبه نمود.

ارگانيسم هائي كه رشد بهتري در حضور دي اكسيد كربن با غلظت بيشتر از هواي اتاق دارند كاپنوفيليك (Capnophilic) ناميده مي‌شوند. اين ارگانيسم‌ها در اتمسفر CO₂ با غلظت 5% تا 10% در يك انكوباتور ويژه با درهاي بدون درز و غير قابل نفوذ انكوبه مي‌شوند.

ارگانيسم‌هاي ميكروآئروفيل به فشار اكسيژن پائين تر از آنچه كه در اتمسفر اتاق وجود دارد احتياج دارند. با استفاده از جار شمعدان (Candle jar) به غلظت دي اكسيد كربن در حدود 3% مي‌توان دست يافت. يك شمع سفيد كوچك را روشن كرده و در داخل جاري كه در آن محكم بسته مي‌شود قرار مي‌دهيم. شمع از اكسيژن محيط استفاده نموده و به علت پائين آمدن اكسيژن محيط خاموش مي‌گردد. محصولات اين احتراق آب و CO₂ هستند كه هر دو از فاكتورهاي رشد ارگانيسم به حساب مي‌آيند. جار شمعدان اغلب جهت كشت نايسريا گنوره مورد استفاده قرار مي‌گيرد. محيط‌هاي كشتي نيز وجود دارند كه حاوي سيستم‌هاي توليد كننده CO₂ مي‌باشند و جهت كشت نايسريا مورد استفاده قرار مي‌گيرند. يك قرص بيكربنات سديم در رطوبتي كه بوسيلة يك كيسه پلاستيكي ايجاد مي‌شود حل شده و مقدار مناسبي CO₂ جهت رشد باكتري پاتوژن توليد مي‌كند. آگار با جلوگيري از جريان تبادلي هواي موجود در سطح مايع شرايط ميكروآئروفيليك كم (minimicroaerophilic) را در حدود 1 تا 2 سانتيمتر زير سطح محيط كشت فراهم مي‌كند. گونه‌هاي لپتوسپيرا را مي‌توان بدين طريق كشت داد.

روش‌هاي ايجاد شرايط اتمسفري بيهوازي در كشت اوليه

روشهاي مرسوم: سيستمي كه بطور معمول جهت ايجاد اتمسفرهاي اختصاصي بيهوازي و كاپنوفيليك مورد استفاده قرار مي‌گيرد جار بيهوازي است. جارهاي بيهوازي موجود شامل گاز پك (Gaspak) و غيره مي‌باشد. در اين سيستم از يك جار پلاستيكي سنگين و شفاف كه درب آن كاملا بسته شده و نسبت به هوا غير قابل نفوذ است، استفاده مي‌شود. ورود يك مخلوط گازي حاوي هيدروژن به جار باعث تركيب هيدروژن و اكسيژن و در نتيجه توليد آب و ايجاد شرايط بيهوازي مي‌گردد. كاتاليست‌هائي مركب از قرص‌هاي آلومينيومي پوشيده شده با پالاديوم كه در يك تور سيمي نگهداري مي‌گردند ترجيح داده مي‌شوند. از آنجائيكه خطر انفجار با اين كاتاليست سرد وجود ندارد بيشتر مورد استفاده قرار مي‌گيرد. اما قرص‌ها در  اثر رطوبت زياد و SH2 غيرفعال مي‌شوند، بنابراين بعد از هر بار استفاده بايد كيسه‌هاي حاوي قرص‌هاي فلزي را تا 160 درجه سانتيگراد در يك فور بمدت 5/1 تا 2 ساعت حرارت داد تا احياء گردند، كاتاليست‌هاي فعال شده را بايد تا زمان استفاده مجدد در يك محيط خشك نگهداري نموده استفاده از جار بدون كاتاليست توصيه نمي‌گردد.

جارهاي بيهوازي با دو روش متفاوت آماده مي‌شوند. ساده ترين روش (به صورت تجاري وجود دارد) استفاده از يك كيسه توليد كننده هيدروژن و CO₂ مي‌باشد كه با اضافه كردن 10 ميلي ليتر آب فعال مي‌شود. درب كيسه را باز كرده و به همراه پليت‌ها در جار قرار داده و به آن آب اضافه مي‌كنيم و سپس درب جار را كاملاً مي‌بنديم. در ظرف چند دقيقه گرما (با لمس جار مشخص مي‌شود) و پس از آن رطوبت در ديواره‌ها ايجاد شده كه نشانگر اين مطلب است كه سيستم كار خود را به طور مناسب انجام داده است. در طي 1 تا 2 ساعت شرايط احياء ايجاد مي‌شود، گرچه انديكاتورهاي متيلن بلو و رزازورين (Resazorin) پس از مدت طولاني‌تري بي‌رنگ مي‌گردند. روش جايگزين ديگر استفاده از سيستم تخليه – جايگزيني مي‌باشد. در اين روش هوا با فشار 25 اينچ (5/62 سانتي‌متر) جيوه از جار خارج مي‌شود.

تكنيك‌هاي Roll-tube , PRAS : محيطهائي كه تحت شرايط بيهوازي توليد مي‌شوند، محيطهاي Pereduced anaerobically sterilized  ناميده مي‌شوند. لوله‌هاي PRAS بوسيلة مخلوط كردن تركيبات محيط و جوشاندن آن به منظور خارج ساختن هواي محلول و سپس خارج ساختن گازهاي آن با استفاده از يك گاز عاري از اكسيژن، ساخته مي‌شوند. در طي مراحل بعدي ساخت محيط (استريليزاسيون، تلقيح و كشت مجدد) بايد از ورود هوا به ظرف جلوگيري نمود. جهت پائين آوردن پتانسيل اكسيداسيون – احياء (Eh) محيط، قبل از استريليزاسيون يك مادة احياء كننده به محيط اضافه مي‌شود.

درجه حرارت انكوباسيون

پاتوژنهاي انساني عموماً در درجه حرارتهائي مشابه درجه حرارت ميزبان رشد بهتري دارند. بنابراين جداسازي پاتوژنها با استفاده از انكوباتور  فقط با استفاده از دو درجه حرارت انجام مي‌گيرد، 35 درجه سانتيگراد، درست مشابه درجه حرارت داخل بدن انسان و 30 درجه سانتيگراد، درجه حرارت سطح بدن، با چند استثناء . همه باكتريها و ويروسهاي پاتوژن مهم را مي‌توان از كشت‌هائي كه در 35 درجه سانتيگراد انكوبه شده‌اند جدا نمود.

pH محيط‌هاي مصنوعي

گرچه محيط‌هاي دهيدراته تجاري تغييرات pH را سريعاً تصحيح مي‌كنند، ولي غلظت يون هيدروژن را بايد با استفاده از يك pH سنج، خصوصاً پس از تغيير pH محيط به دليل اضافه كردن مواد افزودني يا جهت مقاصد خاص، دوباره تنظيم نمود. بايد يادآوري گردد كه الكترودهايpH بر اساس درجه حرارت تنظيم شده اند، بنابراين قرائت pH بايد در درجه حرارت 28 درجه سانتيگراد يا درجه حرارت اتاق اندازه‌گيري شود.

روش هاي كشت :

1.  روش شعاعي   
2. روش كشت T
3. روش كشت ممتد
4. كشت يك چهارم

     در ادامه به خصوصيات برخي از محيطهاي مصنوعي كه به طور معمول مورد استفاده قرار مي‌گيرد خواهیم پرداخت .....