مكانيزم جداسازي در كروماتوگراف
جداسازي پروتئين در كروماتوگراف به دو كلاس شيميايي و فيزيكي انجام مي شود شامل : تعويض يوني ، تفكيك كردن ، جذب سطحي ، انتخاب بر اساس اندازه و مكانيسم پيوستگي مي باشد . در مراحل اوليه پيدايش كروماتوگرافي علوم آزمايشگاهي ها از دو روش تغيير يوني و همچنين مكانيسم تفكيكي يا پارتيشني استفاده مي كردند .
كروماتوگرافي تعويض يوني
كروماتوگرافي تعويض يوني بر اساس تغيير يونها استوار است . در اين روش بار سطح ثابت (فاز ثابت) با بار مخالف خود در فاز متحرك ، تعويض مي شود . بر اساس شرايط ، مواد محلول كاتيون (بار مثبت) و يا انيون (بار منفي) هستند . آنها بر اساس باريوني متفاوت خود و يا بر حسب مقدار بار يوني جدا مي شوند . سطح ظريفي از رزين و يا سليكا ميتواند فاز ساكن را در اين نوع كروماتوگراف تشكيل دهد كاتيون و يا انيون ها در اين حالت بر روي فاز ساكن اندوده مي شود و يا با پيوند شيميايي به آن (فاز ساكن) متصل مي شود . براي حفظ بار الكتروشيميايي با تعويض يون ها ، counterion در نزديكي فاز ساكن تعبيه مي شود . يون هاي محلول در فاز متحرك با counterion تعويض بار مي شوند سپس يون هاي محلول با تغيير ph ، قدرت يوني و يا هر دو فاز متحرك شسته و انتخاب مي شوند .
تعويض كاتيوني ، حاوي دسته از بار هاي منفي است كه براي جداسازي و يا "تعويض" ذرات كاتيوني استفاده مي شود . (يعني ذراتي محلولي كه داراي بار مثبت هستند) . براي نمونه : اسيد هاي قوي مانند يون هاي سولفونات و اسيد هاي ضعيف مانند يونهاي كربوكسيلات ، كربوكسي متيل ، فسفات ، سولفومتيل ، سولفواتيل و يا سولفوپروپيل .
تعويض انيوني براي جداسازي محلول هاي آنيوني مورد استفاده قرار مي گيرد . انها داراي آمين هاي تترامري هستند كه داراي بار مثبت هستند . براي نمونه : تري تيلامينواتيل و يا گروه هاي ضعيف مانند آمينواتيل ، دي اتيل آمينواتيل ، گوانيدواتيل ، اپي كلرودين-تريتانول آمين .
كروماتوگرافي تعويض يوني داراي استفاده هاي گوناگوني در زمينه تشخيص بيماري است . جداسازي امينواسيدها ، جداسازي پپتيدها ، جداسازي پروتئين ها ، جداسازي نوكلئوتيدها و اليگونوكلئوتيدها و نوكلئيك اسيد در آزمايشگاه تشخيص طبي بر اساس اين روش انجام مي گيرد . جداسازي يون هاي غيرآلي از مخلوط هاي آبكي يكي ديگر از استفاده هاي مهم كروماتوگرافي تعويض يوني است . براي مثال ، آب ديونيزه ، با استفاده از ستون هاي رزيني كاتيوني و آنيوني به دست مي آيد .
كروماتوگرافي پارتيشني (تفكيكي)
توزيع متفاوت ذره حل شونده در دو مايع غير قابل مخلوط با هم اساس كروماتوگرافي تفكيكي است . مايع مخلوط ناشدني اولي نقش فاز ساكن را دارد . براي تهيه اين فاز ، لايه نازكي از مايع با پيوند شيميايي و يا با جذب سطحي بر روي ذره مورد نظر و يا داخل ديواره ستون موئينه اي اندوده مي شود . جداسازي بر حسب تفاوت در قابليت حل مولكول هاي محلول بين فاز ساكن و فاز متحرك انجام مي گيرد . كروماتوگرافي تفكيكي همچنين به دو دسته gas-liquid chromatograohy و liquid – liquid chromatography تقسيم بندي مي شود . LLC هم خودش به دو نوع فاز نرمال و يا فاز معكوس تقسيم بندي مي شود . در LLC فاز نرمال ، مايع قطبي (از نظر بار) به عنوان فار ساكن استفاده مي شود و يك حلال غيرقطبي به عنوان فاز متحرك خواهد بود . در كروماتوگرافي LLCفاز معكوس ، فاز ساكن غير قطبي است در حالي كه فاز متحرك قطبي است . توقف – يوني و كروماتوگرافي جفت – يوني دو فرم از كروماتوگرافي فاز معكوس LLC هستند كه براي جداسازي ذرات محلول مورد استفاده قرار مي گيرد . در كروماتوگرافي توقف – يوني بخش يوني باز و يا اسيد ضعيف يا خنثي مي شود و يا با تغيير ميزان PH فاز متحرك،ساپرس (متوقف ) مي شود . با خنثي سازي گروه يوني ، محلول داراي قطبيت كمي خواهد بود و در نتيجه قابليت متصل شده به فاز ساكن غير قطبي در ان بيشتر مي شود . ذرات ساپرس شده هم ويگي هاي همانند ذرات خنثي دارند و با استفاده از كروماتوگرافي فاز معكوس جدا مي شوند . از كروماتوگرافي جفت – يوني هم براي جداسازي داروهاي درماني و متابوليسم آنها استفاده مي كنيم .
كروماتوگرافي جذب سطحي
اساس اين نوع كروماتوگرافي هم بر اساس تفاوت در جذب سطحي و يا عدم جذب سطحي بر روي ذره اي جامد است . نيرويهاي الكترواستاتيك و همچنين پيوند يوني برهمكنش هاي فيزيكي هستند كه اين نوع كروماتوگرافي را كنترل مي كنند . در GC از اين متد براي جداسازي تركيبات داراي وزن مولكولي كم (مانند : متيل ، اتيل ، الكلهاي ايزوپروپيل) و همچنين تركيباتي كه داراي فاز گازي در دماي اتاق هستند استفاده مي كنيم .
كروماتوگرافي انتخاب بر اساس اندازه
Size-exclusion chromatography همچنين به نام هاي فيلتراسيون ژل ، تراوش ژل ، ممانعت مولكولي و كروماتوگرافي مولكولي مشهور است . اساس اين نوع كروماتوگرافي بر جداسازي ذرات بر اساس اندازه هاي مولكولي انها استوار است . شكل مولكولي و هيدارته شدن انها فاكتورهاي تاثير گذار در اين نوع كروماتوگرافي است . مواد گوناگوني به عنوان فاز ثابت در اين روش مورد استفاده قرار مي گيرد . مثلا : دكستران كراس لينك ، پلي آكريل آميد ، آگاروز ، پليسترين و ... . با كنار هم قرار گرفتن اين مواد خلل و فرج هاي بسيار كوچك موقتي ايجاد مي شود كه مي تواند مولكول هاي كوچك را موقتا به دام بيندازد . مولكول ها با اندازه بزرگ در فاز متحرك باقي مي مانند و به سرعت از ستون شستشو داده مي شوند . از اين نوع كروماتوگرافي براي مقاصد تحقيقاتي و تجزيه اي استفاده مي شود .
كروماتوگرافي پيوسته
در اين نوع از كروماتوگرافي ، از برهم كنش هاي ويژه و اختصاصي بيولوژي براي جداسازي ذرات استفاده مي كنيم .پيوند آنزيم – سوبتسرا ، هورمون – گيرنده و يا آنتي ژن – آنتي بادي در اين نوع از كروماتوگرافي استفاده مي شود . اهميت اين تكنيك در قدرت بالاي انتخاب آن است . در آزمايشگاه از اين روش براي جداسازي هموگلوبين هاي گليكوزيله (ستون فنيل برونات - phenyl boronate columns ) وليپوپروتئين هاي LDL و VLDL (ستون هپارين) استفاده مي شود . همچنين از اين روش براي تهيه پروتئين ها و آنتي بادي ها در مقادير كمي زياد براي مقاصد تحقيقاتي بهره مي بريم .
برچسبها:
كروماتوگرافي تعويض يوني,
كروماتوگرافي پارتيشني,
تفكيكي,
كروماتوگرافي جذب سطحي
